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如何从小白成为扎细胞小能手
点击次数:192 发布时间:2018-09-28

看到了很多做分子细胞的小伙伴分享了经验心得,今天也想来试着分享一下神经电生理(在此仅指急性脑切片膜片钳技术)方面的一些小经验。

 

 

 

实践篇——知其然

 

扎细胞的基本操作步骤:

 

1)配好 ACSF 充氧(tip:氧要饱和!根据实验对象、目的、课题设计等各种主客观情况选用合适的方法技术)

 

2)打开各种仪器。基本就是循环灌流系统(简单地说就是蠕动泵,使脑片记录槽中氧饱和的人工脑脊液不断更换,可防止脑片细菌滋生)、显微观察系统(tip:Olympus、Zeiss 等guan网可以了解很多相关知识)、记录采集系统三大模块。(tip:在记录槽充满溶液的时候再打开加热器,干烧容易把电阻烧坏;先开硬件,再开软件,否则会报错!)

 

3)拉制电极。一般记录细胞的电极尖端阻值为 3~5 MΩ。尖端太细,破膜后容易重新被阻塞,影响记录状态。

 

4)从 -20 ℃ 取出人工细胞内液(冰上保存,因为内液里有 ATP,温度太高会分解),DIY 针管注射器,烧软稍凉一会儿再拉伸成适合粗细长度。

 

图 1

 

5)用自制 pipette(玻璃吸管)从自制 chamber(孵育杯)中取出脑片,此时应保证记录灌流通路的溶液环境不会缺少氧气。

 

6)用铂金片背面压住脑片(tip:保证尽可能固定,否则脑片震动使记录不稳定),调整 DIC 至能清晰看到立体饱满的细胞形态(此处插播「何为 DIC」: 中文名——微分红外干涉相差成像,就是可以用来观看细胞形态的黑白小电视)主要调节聚光镜光斑,使光斑最集中点落在脑片上。有时一直白茫茫一片,可能是光源太亮而过度曝光,或者是镜头与液面之间有气泡。此时只需调小亮度或是抬起镜头重新入水即可。

 

7)用之前 DIY 拉伸好的注射器向微电极中灌注内液,内液应没过电极中的银丝,才能与记录液中的地线连通整个电路,给电极合适正压。(tip:气压太大对脑组织扰动太大,太小脑组织不能被吹开,会阻碍电极接近细胞。)

 

8)用显微镜找好目标细胞,然后找电极。(图 2—6)

 

图 2. DIC 图中的电极尖端

 

图 3.DIC 图中的脑片表面

 

图 4. DIC 图中带着正压的电极尖端接近细胞

 

图 5. DIC 图中的电极正压将细胞膜表面吹出小坑

 

图 6. DIC 图中释放正压的电极尖端与细胞膜形成高阻封接

 

9)电极入水后点击放大器面板(附图 7)的 Offset 及测试电压方波 Seal test。

 

 

10)将微操作器行进速度降低至 3 档,电极尖端阶梯式接近细胞(tip:一定要看到组织适当被吹开,细胞形态变清晰的感觉),从斜正上方压细胞,发现即将出现(tip:注意时机,迅速把握)气压吹出的坑时立即释放正压,当示波器波形由刚开始的方波形变成一条直线(即电极与细胞膜之间形成 GΩ高阻封接)时,快速点击 Holding。

 

11)然后补偿快慢膜电容,用负压破膜,至此连通了电极内液与细胞内液。(tip:破膜过程可以使用 zap 电击辅助破膜。电容充放电越快,说明破膜情况越好。)

 

12)根据实验目的给细胞不同电刺激,记录电信号。(图 8)

 

 

13)对于脑片出现细菌的小问题,在不做实验时可用 3% 过氧化氢灌流冲洗整个水路(循环灌流通路)再用双蒸馏水冲洗,以防过氧化氢影响细胞状态。

 

 

 

理论——知其所以然

 

1)多位前辈代代相传的入门宝典:

《电生理学方法与仪器入门》,(荷)布雷特奇德著,机械工业出版社(一本深蓝色小书);《实用膜片钳技术》,刘振伟著,军事医学科学出版社(绝对是经典,必备);

 

2)电生理记录仪器认知要点:

 

信号放大器——通过二极管对微小的模拟信号进行放大数模转换器——只认识电压指令,是放大器的模拟信号与电脑的数字信号之间进行沟通的桥梁信号采集记录软件(Spike2,signal 或 pClamp……)

 

 

 

其他碎碎念

 

 

如何找到目标脑区?

个人觉得一个不熟悉的脑区,首先通过查图谱进行了解。靠谱的图谱可以是 Allen brain institute(图 9),包括各脑区的基本轮廓(立体、水平切面、矢状切面、冠状切面)、基因表达、细胞投射等情况。也可以是相应的大鼠、小鼠脑图谱外文原版书籍。

 

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