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你已经是个成熟的细胞了,该学会自己做实验了
点击次数:754 发布时间:2018-10-24

实验室里大家都埋头做实验,可为什么老板每次都骂我们,你都快 30 的人了这也不会那也不会,白长这么大了,栽培了你那么多年到头来啥也指望不上。对此,我深感委屈,那个细胞我养了那么久,它还是那样衣来伸手饭来张口,我有怪过谁么?

 

首先,这么大的细胞了,除了要自己学会传代之外,鄙人对你们还有更高的要求,你该学会自己做实验了。

 

 

来,先跟我说说细胞系和细胞株的区别。

 

细胞:原代培养物经过次传代成功的细胞就是细胞系,可泛指一般可能传代的细胞。而通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养物称为细胞株,也就是说,细胞株是用单细胞分离培养或通过筛选的方法,由单细胞增殖形成的细胞群。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。

 

简而言之,细胞系概念强调细胞系是传代成功后的细胞群,细胞株概念强调细胞群的纯度,认为细胞株是克隆的结果。

 

那再来说说,什么是稳定转染和瞬时转染。

 

细胞:稳定转染,就是进入细胞的质粒整合入细胞基因组中,并能随细胞分裂稳定传递下去。瞬时转染表达时间短暂,外源基因导入整合基因组的几率非常低,绝大部分以游离形式存在,不能随细胞分裂而一同复制,导致后拷贝数被稀释,无法达到持续表达外源基因的目的。一般用转染试剂进行质粒转染,多是瞬时转染。

 

 

非常好,你能区分什么时候需要构建稳转株吗?

 

细胞:需要构建稳转株的,有这些类型:

 

1. 长期在目的细胞中研究基因功能;

 

2。 部分蛋白半衰期极长,瞬时 RNA 只能干扰表达,无法去除已经表达的目的蛋白,想要实现更好的基因干扰效果;

 

3. 想要实验更,筛选拷贝数适量的细胞进行实验研究;

 

4。 需要用诱导表达系统的,主要是一些致死基因或者是需要时空表达的;

 

5. 需要用细胞做动物实验的,比如裸鼠成瘤等。

 

以下实验就不需要构建稳定株:

 

1. 希望迅速观察目的基因过表达或者干扰效果;

 

2. 2~4 天的瞬时表达已经可以达到具体的实验目的,比如检测两个外源转染的目的蛋白之间的相互作用;

 

3. 细胞个体差异对实验结果有影响。

 

 

那再来跟我汇报下什么是基因过表达、干扰或基因敲除?应该怎么选择?

 

细胞:过表达就是把基因上调表达,即该基因被过度的转录、翻译,终基因表达产物超过正常水平。做过表达要比做干扰难度高一些,过表达需要表达出长链的 mRNA,这一点比较困难,而干扰只需表达出短片段的 shRNA 即可。

 

一般情况下,如果本身就是高表达,你再做过表达就比较困难,某种程度上干扰更为重要,想说明一个基因对于一个事件是必须的,只有把它拿掉,事件终止(或程度减弱),才比较有说服力。但是,如果你的基因在细胞中基础表达本身就不高的话,还是有必要来选择过表达实验来对其表型进行验证的,否则实验会受到质疑。

 

关于下调基因表达,一般来说干扰稳转株能满足实验所需。但是,干扰稳转株不能控制 shRNA 插入染色体的位置,染色体上的 shRNA 有时会丢失,另外 shRNA 也有脱靶效应,可能干扰了其他未知基因。还有就是,shRNA 是与目的基因的 mRNA 作用而使之降解,是在 RNA 水平上的降低目的基因的表达。

 

此时,基因敲除稳转株可以很大程度上规避这个问题。因为基因敲除稳转株是在基因组水平上通过基因序列的改变使其基因功能丧失,在敲除细胞中通常不会检测到靶蛋白的表达,而且敲除效果稳定,不能恢复,也就是yong久性敲除了。但是基因敲除稳转株缺点是操作周期长,费用多,效率低。如何选择基因下调表达的方式,就要综合考虑了。

 

那么同样是稳定株,单克隆?混合克隆?要怎么选?

 

细胞:当需要去除细胞群体干扰因素的时候,推荐使用单克隆稳定细胞株,其基因组背景相对单一,对实验结果干扰因素小。当进行系统生物学研究时,需考虑细胞群体因素,同时也是由于不同细胞个体差异大,而且不同整合位点的单克隆细胞株表现出来的细胞行为可能不一致,所以许多实验使用混合克隆株更能去除细胞间差异造成的干扰。因此,选择单克隆细胞株还是混合克隆细胞株,需要根据实验目的而定。

 

好极了,怎么判别筛选的稳定株是单克隆呢?

 

细胞:如果外源片段含有荧光标记,可以直接使用流式细胞仪检测其荧光是否均一;如果还有其它标签,可以进行免疫荧光标记,再使用流式细胞仪观察荧光分布是否出现均一峰值;

 

如果外源片段不含任何标签或者荧光标记,则可以使用分子生物学比如 Southern Blot 的方法鉴定; 还可使用 96 孔板稀释法筛选,得到的阳性克隆一般是单克隆。

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