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单细胞悬液制备秘籍
点击次数:426 发布时间:2019-01-07

10x Genomics 单细胞项目一直是如火如荼,而单细胞悬液制备顺势成为该项目的关键,小编整理了晶能生物 2 年多 10x 项目经验及 10x Genomics 网zhan相关资料,为你带来神秘「单细胞悬液制备」秘籍。

为保证细胞活力,新鲜的样本不能冻存且长距离运输,小编建议提前预约,公司会安排上门建库服务。上机前样本要求如下:

  • 细胞浓度:5x105~1.2x106/ml
  • 细胞数量:1x105 cells/sample


样本制备的具体方案因样本类型而异,但无论采用哪种方案,都必须确保上样的细胞有活性。对于悬浮细胞系、磁珠富集细胞和流式分选细胞已呈悬浮状态,只需要洗涤和计数即可。固体组织和其他大细胞聚合体必须使用机械或酶解离,细胞分选或其他细胞分离技术解离成单细胞悬液状态。

样本制备一般有什么策略? 

  • 组织样品须通过酶促解离制成单细胞悬液
  • 细胞数量较少(小于 100 000)的样品可适当减少洗涤次数
  • 细胞直径过大的样品,可以分离细胞核,制备细胞核悬液
  • 植物细胞须去除细胞壁得到原生质体悬液


样本制备应遵循什么原则?

  • 建议使大口径枪头重悬,以减少对细胞的损伤
  • 每次移液前先混匀细胞悬液,然后从管中部吸取
  • 弃上清时注意不要破坏细胞沉淀
  • 取样时hao设置两个重复,对每个样品计数 2 次
  • 一般选用含 0.04 % BSA(400 μg/ mL)的 1× PBS 溶液重悬和洗涤细胞
  • 重悬细胞浓度洗涤和重悬细胞时,总体积浓度不低于 5 000 个细胞/μl;理想的范围保持在 700~1200 cells/ μL,此浓度下计数较为准确
  • 有些细胞如 PBMC 在 PBS 中易成团状,从而降低细胞的有效浓度,因此制备细胞悬液要迅速,hao在 30 分钟内完成
  • jia上样体积为 2.5 μL~15 μL


样品质量有什么要求?

  • 悬液干净、无过多杂质及细胞团
  • 细胞存活率>90%(比较难处理的样本可以放宽至>80%)
  • 细胞直径<40 um


若单细胞悬液中存在死亡或垂死细胞,细胞团,细胞碎片,游离 mRNA 会导致:

  • 细胞捕获率低
  • 低文库复杂性(UMI 检出率下降/gene 表达量低)
  • 有效细胞 reads 数低
  • cDNA 得率偏低


如何获取高质量样品?

1. 细胞清洗:

推荐的洗涤悬浮液为含 0.04% BSA 的 PBS,至少洗涤一次,减少细胞损失或聚。

原代细胞,干细胞和其他敏感细胞类型需大细胞活力,必要时可用常见细胞缓冲液替换 PBS。

2. 细胞过滤:

细胞团或细胞碎片会增加微流体芯片的堵塞风险。为避免这种状况,建议在上样前使用细胞滤网(cell strainer),孔径大约为 30~40 μm,进行过滤。

低细胞悬浮液体积建议使用 Flowmi™Tip 过滤 , 样品体积损失小,细胞浓度降低 30% 左右。

常规体积建议使用 MACS SmartFilter 过滤,样品体积损失 100 ul 左右,细胞浓度影响不大。

3. 准确测定细胞活力

4. 组织优化分离方案


适宜制备时间

适宜分离条件(时间/温度/酶类型和浓度/离心转速、温度、时间)

5. 大口径移液管对细胞进行吹打,避免造成细胞损伤。

细胞计数有什么策略?

计数结果干扰会过低或过高估计细胞存活率,细胞上样浓度一般:700~1200 个细胞/µl 的范围。在次表征样品类型时,建议进行两种不同的方法计数和活力测定。

  • 台盼蓝染色法,操作简单,但小细胞难以准确计数及活力测定
  • 荧光染料染色法,结果相对直观,计数和活力准确


如果,细胞数<100 000,样本制备应该注意什么?

  • 样品分选至合适培养基
  • 清洗前进行一次计数
  • 水平离心机离心,PBS 至少清洗一次
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