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多年 CCK-8 经验总结请收好,这些坑不要再跳了
点击次数:336 发布时间:2019-01-14

在细胞培养实验过程中,大家是不是总会好奇别人家的实验总是做的又快又好,而自己做的实验又慢又难得做出自己满意的结果,搞得一天到晚也挺忙的,心想:我也很努力很认真啊,为啥效率总提不起来呢?

 

其实,有时候并不是自己不努力,只是没有找对方法。做实验可不能光是埋头苦干,还要学会运用合适的检测试剂盒,这样就能事半功倍。

 

如果你还在用 MTT,那就真的 OUT 了,MTT 花 4 小时才能得到的结果用 CCK-8 只需 1 小时,CCK-8 可用于细胞增殖和毒性分析,同 MTT 法相比,CCK-8 即开即用,检测时间大概在 1 小时左右。

 

不仅如此,CCK-8 对细胞的毒性极小,完全可以测完细胞增殖或药物毒性后再继续用细胞进行下游实验。下面小编就来为大家介绍一下 CCK-8 的具体情况。

 

CCK-8 基本原理

基本原理为:该试剂中含有 WST-8【化学名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2 H-四唑单钠盐】,它在电子载体 1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物(Formazan dye)。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。

 

 

图 1。 WST-8 检测原理图 EC=electron coupling reagent,即电子耦合试剂)

 

 

图 2. CCK-8 检测细胞活性原理图

 

 

产品用途

主要用于药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验。

 

细胞毒性检测的实验对比

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表 1. 细胞毒性检测的实验对比

 

CCK-8 的实验方法与步骤

实验一:细胞活性检测

 

1. 收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,96 孔板每孔加入 100 μL, 使待测细胞调密度至 (1,000~10,000)/ 孔。

 

2. 5% CO2,37℃ 培养细胞 24 小时(培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而异)。

 

3. 每孔加入 10 μL CCK-8 溶液。如果起始的培养体积为 200 μL,则需加入 20 μL CCK-8 溶液,其它情况以此类推。

 

4. 在细胞培养箱内继续孵育 0.5~4 小时,对于大多数情况孵育 1 小时就可以了。时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定(一般情况下,白细胞较难显色,因此需要较长的 CCK-8 反应时间或增加细胞数量。悬浮细胞与贴壁细胞相比较难显色。对于贴壁细胞,CCK-8 的培养时间一般为 1~4 小时,注意:CCK-8 的jia反应时间以具体显色的jia时间为准)。初次实验时可以在 0.5、1、2 和 4 小时后分别用酶标仪检测,然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。

 

5. 在 450 nm 测定吸光度。

 

 

☆ 实验二: 细胞增殖 - 毒性检测

 

1. 收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,96 孔板每孔加入 100 μL, 使待测细胞调密度至 (1,000~10,000)/ 孔。

 

2. 5% CO2,37℃ 培养细胞 24 小时(培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而异)。

 

3. 加入 10 μL 不同浓度的待测物质,将培养板在培养箱孵育一段适当的时间 (例如 6、12、24 或 48 小时)。

 

4.  每孔加入 10 μL CCK-8 溶液。如果起始的培养体积为 200 μL,则需加入 20 μL CCK-8 溶液,其它情况以此类推。

 

5.  在细胞培养箱内继续孵育 0.5~4 小时,对于大多数情况孵育 1 小时就可以了。时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定(一般情况下,白细胞较难显色,因此需要较长的 CCK-8 反应时间或增加细胞数量。悬浮细胞与贴壁细胞相比较难显色。对于贴壁细胞,CCK-8 的培养时间一般为 1~4 小时,注意:CCK-8 的jia反应时间以具体显色的jia时间为准)。初次实验时可以在 0.5、1、2 和 4 小时后分别用酶标仪检测,然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。

 

6.  在 450 nm 测定吸光度。

 

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图 3. 实验操作示意图 

 

 

☆ 注意事项:

 

如果待测物质有氧化还原性,可在加 CCK-8 之前更换新鲜的培养基,去掉待测物质的影响。

 

 

☆ 计算公式:

 

  • 细胞存活率 = [(实验孔 — 空白孔)/ (对照孔 — 空白孔)] × 100%

  • 抑制率 = [(对照孔 — 实验孔) / (对照孔 — 空白孔)] × 100%

  • 实验孔 (含有细胞的培养基、CCK-8、待测物质)

  • 对照孔 (含有细胞的培养基、CCK-8、没有待测物质)

  • 空白孔 (不含细胞和待测物质的培养基、CCK-8)

 

 

注意事项

1. 次做实验时,建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入 CCK-8 试剂后的培养时间。

 

2. 接种时注意细胞悬液一定要混匀,以避免细胞沉淀下来,导致每孔中的细胞数量不一致。

 

3. 培养板周围一圈孔培养液容易挥发,为减少误差,建议培养板周围的四边每孔只加培养基。

 

4. 建议采用多通道移液器,减少平行孔间的误差,加 CCK-8 时,建议斜贴着培养板壁加,不要插到培养基液面下加,容易产生气泡,干扰 OD 值。

 

5. 若细胞培养时间较长,培养基颜色或 pH 发生变化,建议更换培养基后再加 CCK-8,含有酚红的培养基不影响测定。

 

6. CCK-8 对细胞的毒性非常低,其他的实验,例如中性红法或结晶紫法 ,也可在 CCK-8 法检测完后继续进行。

 

7. 可以使用大于 600 nm 的波长,例如 650 nm,作为参考波长进行双波长测定,CCK-8 在参比波长处没有吸光值,设定参比波长的目的是为了去除由于样品浑浊所带来的吸收。

 

8. 如果实验中待测物质有氧化还原剂,在不含细胞的培养基中加入药物,然后加入 CCK-8 试剂在一定时间内检测,和不加药物的培养基进行比较 (只加 CCK-8 试剂),如果 OD 值明显偏高,则说明有反应。

 

9. 加 CCK-8 试剂时速度要快,减少试剂在移液器上的残留,加入 CCK-8 试剂后轻轻震培养板,为了避免加样时由于 CCK-8 残留在枪头上所带来的误差,可以在加样前用培养稀释 CCK-8 试剂并混匀后加样。

 

10. CCK-8 反复冻融会增加背景值,干扰实验测定。

 

CCK-8 常见问题解答

☆ CCK 的保存和稳定性如何?

 

答:CCK 稳定性高,避光条件 -20℃ 有效期 2 年,4℃ 有效期 1 年。经常使用建议 4℃ 保存,避免反复冻融。CCK 正常颜色为粉红色,若颜色发生明显偏差,质量可能有发生变化。

 

 

☆ CCK 会对活细胞进行染色吗?

 

答:不会,首先 WST-8 不会进入细胞染色,整个显色反应都是在培养体系中进行的。另外 WST 和 WST-8 甲臜都属于高度水溶性组分,反应结束更换新的培养液,即可清除外源组分。

 

 

在加入 CCK-8 时可否不更换培养基?

 

答:一般情况下可以不更换培养基。但是如果培养基里有氧化还原性物质的话,有可能会产生误差,必须更换其它培养基。

 

 

☆ 若是使用 6 孔或者 24 孔板进行试验,CCK 试剂使用量怎么样呢?

 

答:如果要使用 6 孔板或 24 孔板实验,请先计算每孔相应的接种量,并按照每孔培养基总体积的 10% 加入 CCK 溶液。

 

 

☆ 能否用 384 孔板进行细胞增殖与活性检测的实验呢?

 

答:可以,CCK-8 产品的使用量为每孔培养基总体积的 10%。建议先将 CCK-8 产品稀释一倍,然后加入培养基总体积的 20% 即可,这样可减少误差。

 

 

☆ 只可以在 450 nm 波长处测 OD 值吗?

 

答:可以在 450 nm 波长处测 OD 值,但是若无此波长的滤光片,可选择吸光度在 430~490 nm 之间的滤光片,但是 450 nm 滤光片的检测灵敏度高。

 

 

☆ 若是暂不检测 OD 值,该如何处理?

 

答:若暂时不测定 OD 值,可以向每孔中加入 10μL0.1 M 的 HCl 溶液或者 1% w/v SDS 溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24 小时内测定,吸光度不会发生变化

 

 

☆ 在实验中 OD 值太高,怎么解决?

 

答:可以缩短加入 CCK-8 后的培养时间。例如:可以把加入 CCK-8 试剂后的培养时间由 2 小时缩短为 1 小时。此外,可适当减少细胞的数量。

 

 

☆ 如果 OD 值太低,怎么解决?

 

答:可以采取 2 个办法:1、适当增加细胞数量;2、延长加入 CCK-8 试剂后的反应时间。

 

 

☆ 应该每次做标准曲线吗?

 

答:建议每次做。虽然细胞是一样的,但是细胞的状态不一定一样。对于状态不一样的细胞,建议每次做标准曲线。

 

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