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TUNEL 法检测细胞凋亡经验总结
点击次数:166 发布时间:2019-02-21

 

用了许多方法检测小鼠的肝脏、脑部、睾丸等组织的细胞凋亡,其中 TUNEL 法做的多,我购买的试剂盒主要是 roche、 promega 公司,结果大多数成功,偶尔也有失败,下面我把实验中的关键问题与大家共享一下,同时也希望能对初学者有所帮忙。

 

 

TUNEL 法的实验原理

 

 

基本原理:对不同组织切片先增加细胞膜通透性,然后让 rTDT 和生物标记的 dTUTP 进入细胞内,在 rTDT 的辅助下 dTUTP 与核断裂的 DNA 3』-OH 结合,再用 HRP 标记的链霉亲和素与 dTUTP 上的 biotin 结合(每个链霉亲和素至少可以再结合 3 个 biotin 分子),后用 DAB、过氧化氢与 SP 上的辣根过氧化物酶 HRP 发生氧化、环化反应,形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色,终通过计数每张切片上不同视野中 TUNEL 阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。(小编碎碎念:掌握原理是做好实验的先决条件,不少人还以为是抗体抗原反应呢)

 

 

TUNEL 实验中关键步骤

 

 

1. 充分脱蜡和水化。脱蜡可以先 60ºC 20 min,再用使用二甲苯两次 5-10 min;而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗,这些以便后面的结合反应充分、均匀;

 

 

2。 把握好细胞通透的时间。一般根据切片的厚薄,选择蛋白酶 k 的孵育时间,常用 10-30 min,几 μm 切片用短时间;几十 μm 切片用长时间,通过摸索达到既不脱片,有能够使后面的酶和抗体进入胞内。

 

 

3. 适当延长 TUNEL 反应液的时间。一般是 37ºC 1 h,你也可以根据你的凋亡损伤程度,选择更长的时间,可长至 2 h,但要结合你终的背景着色。

 

 

4.DAB 显色条件的选择。一般 DAB 反应 10 min 左右,结合镜下控制背景颜色,长不超过 30 min;promega 公司提供的 DAB 液(桃红色),不利于辨认棕褐色,我不太喜欢。

 

 

5.PBS 的充分清洗。我个人认为,在 TUNEL 反应后和酶标反应后的清洗应十分严格,可增加次数达 5 次,因为这些清洗直接决定后切片的非特异性着色。

 

 

6. 此外,内源性 POD 的封闭也十分关键。对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织,我的经验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度,可以达到很好的封闭效果,且不影响终的特异性染色。

 

 

细胞通透的时间选择

 

 

1. 蛋白酶 k 的目的是通透细胞膜和核膜,从而使反应试剂充分进入细胞核进行反应,提高阳性率。但浓度过高或孵育时间太长容易脱片,只要不脱片,好像影响不大,其作用类似与 TritonX100 等细胞通透剂。

 

 

2. 蛋白酶 K 一般工作液浓度为 20 μg/ml, 但浓缩液可配制 1-10 mg/ml,可用 PBS 配制,也可用蛋白酶 K 缓冲液(100 mM Tris HCl pH8.0+50 mM EDTA);然后分装成小份,用完一支再用下一支,-20ºC 保存 1 个月应该没问题的(重复拿的那支),而一直冷冻的至少可以用半年以上。

 

 

3. 蛋白酶 K 反应时间一般为 10-30 min,具体时间长短与切片厚薄有关,4 μm 左右的片子可以用 10 min,但 30 μm 左右的可用 30 min,终通过摸索jia时间。过长易脱片、过短起不到通透效果。

 

 

关键试剂操作条件

 

 

DAB 显色反应大约需要 10 min,要控制好反应时间,勿使背景颜色过深。具体的可能还是得根据切片组织来源和切片厚度、试剂盒种类不同来摸索一下。

 

 

蛋白酶 K 工作液处理时间、温度须在范围内摸索,温度过高,时间过长,易破坏核酸结构,出现假阳性。

 

 

DNase 1 一般室温,10 min 即可。

 

 

如何减弱非特异性染色

 

 

若是肝脏或肾脏,因富含内源性过氧化物酶,需要增加过氧化氢浓度和延长孵育时间。其他还可以加强灭活、缩短 DAB 孵育时间、PBS 充分清洗,注意镜下把握好着色。

 

 

其他注意事项

 

 

1。 湿盒用带盖方盘,里面固定几根玻璃吸管用于放玻片,使用时稍加水即可。

 

 

2. 英文说明书中对组织细胞通透这一步中,加了「对难处理的组织的处理」,意思是用常规方法处理(如蛋白酶 K) 后,应该阳性而做不出阳性时,可用微波修复。

 

 

3. 复染的目的是为了衬托组织形态结构,以利于结果分析,石蜡切片常用苏木素,核染成兰色,冷冻切片常用甲基绿,核染成绿色。

 

 

4.PBS 用蒸馏水、Na2 HPO4、KH2PO4 配制,现在有卖的,自己加蒸馏水稀释后即可用,很方便,也不贵。

 

 

5。 蛋白酶 K 消化蛋白后,需要用封闭液。

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