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各类western转膜条件
点击次数:293 发布时间:2019-02-22

除了抗体原因,转膜恐怕是western blot成败的关键因素。

 

因此我们总结了一系列分子量蛋白转膜的时间,希望对大家有用。

蛋白来源:RAW264.7 总蛋白

蛋白名称(可保密):一些转录因子

蛋白分子量:40~70 KD

WB用膜类型、孔径:0.45 NC

转膜方式(恒压、恒流):湿转 恒流400 mA

转膜时间:60~90 min

PS。其实吧,以我的经验来看,除非目的蛋白特别小,或者特别大,不然转膜时间真的不是那么重要,曾经因为失误,转了15 min就拆下来了,但从丽春红染色来看,跟平常实验也没有太大的区别。

 

蛋白来源:内皮细胞 总蛋白

蛋白名称(可保密):occludin & AKT

蛋白分子量:65 KD & 56 KD

WB用膜类型、孔径:0.45 PVDF

转膜方式(恒压、恒流):湿转 恒压 100 V

转膜时间:60~70 min

设备名字是“Bio-Rad mini”。

蛋白来源:乳鼠心肌细胞和成年鼠心肌组织 总蛋白和核蛋白

蛋白名称(可保密):保密

蛋白分子量:65 KD & 55 KD

WB用膜类型、孔径:PVDF(预先用甲醇处理)

转膜方式(恒压、恒流):半干转 恒压 12 V

转膜时间:30-40 min

设备:“Bio-Rad mini”

建议:开始做过湿转(过夜的那种),太费事费时,效果也不如半干转。

蛋白来源:293T细胞

蛋白名称(可保密):

蛋白分子量:95 KD & 35 KD

WB用膜类型、孔径:PVDF

转膜方式(恒压、恒流):湿转 恒压 90 V-110 V,控制电流不要超过300 mA。

转膜时间:70 min

蛋白来源:肿瘤手术标本

蛋白名称(可保密):转录因子

蛋白分子量:33 KDa

WB用膜类型、孔径:PVDF膜

转膜方式(恒压、恒流):350 mA 恒流

转膜时间:150 min

转膜设备:湿转 Bio-Rad

说明:相同条件曾用于数个30-70 KDa的蛋白,都能成功转上,不过没有试缩短时间效果如何;实验时没为转膜条件苦恼,倒是电泳时胶的浓度及时间根据不同分子量而有区别。

 

蛋白来源:成纤维细胞

蛋白名称(可保密):smad3

蛋白分子量:54 KDa

WB用膜类型、孔径:PVDF膜

转膜方式(恒压、恒流):350 mA 恒流

转膜时间:150 min

转膜设备:湿转 Bio-Rad

蛋白来源:胰腺癌细胞

蛋白名称(可保密):

蛋白分子量:16 KDa and 42 KDa

WB用膜类型、孔径:PVDF膜

转膜方式(恒压、恒流):120 V 恒压

转膜时间:90 min

转膜设备:湿转 Bio-Rad

 

蛋白来源:大鼠血管平滑肌细胞

蛋白名称(可保密):保密

蛋白分子量:72 KD,42 KD 和22 KD

WB用膜类型、孔径:一般的PVDF膜

转膜方式(恒压、恒流):湿转,恒流一张膜0.26 A,两张膜0.3 A。
转膜时间:90 min

设备:“Bio-Rad mini”

建议:转膜缓冲液多用3次,hao现用现配,我们用的没有加SDS,转的时候hao能用冰块一类的东西降一下温,这样转的效果要好一些,转的时候一定要把三明治每层之间的气泡除去,同时使滤纸大于膜,膜大于胶,以免烧坏电极。

蛋白来源:大鼠PBMC

蛋白名称(可保密):保密

蛋白分子量:55 KD

WB用膜类型、孔径:0。22的PVDF膜

转膜方式(恒流):湿转
转膜时间:60-90 min

设备:“Bio-Rad mini”

建议:转膜液用过两三次之后转膜效果就很差了 其它按照常规就好了 其实0.22的膜一般不怕转过头 以我们的经验,转膜时间、电压其实也有很大范围的调整 ,并不是非要固定于哪一个合适,曾经做过 一张膜转,17 KD的和170 KD的,按照170 KD的条件,17 KD的转膜也很好的。

 

蛋白来源:人非小细胞肺癌细胞系

蛋白名称(可保密):保密

蛋白分子量:大于250 kD

WB用膜类型、孔径:millipore PVDF膜 0.45 um

转膜方式(恒压、恒流):湿转,恒流0.3A。
转膜时间:180min

设备:“Bio-Rad ”

建议:电转保持电压在70 V以上,保持低温,如果电压低过70就需要换缓冲液了。

 

蛋白来源:白血病细胞

蛋白名称(可保密):保密

蛋白分子量:28 KD

WB用膜类型、孔径:0.45的NC膜

转膜方式(恒流):湿转,90 min,0。25 A

设备:“Bio-Rad ”

建议:海绵厚度要合适,一次转磨用的海绵太薄,导致三明治没夹紧,转膜后拿出来一看,marker都变得七扭八歪。但是有前辈说垫的海绵太厚可能将胶压断,没经历过,不知道是不是会有这种情况。

蛋白来源:肿瘤细胞

蛋白名称(可保密):磷酸化蛋白

蛋白分子量:10-200 KDa

WB用膜类型、孔径:millipore PVDF膜 0。45 um

转膜方式(恒压、恒流):120 v 恒压

转膜时间:120 min

转膜设备:湿转 Bio-Rad

建议:转膜缓冲液只用2次,基本都转上,5%BSA封闭,减少背景。

蛋白来源:胰腺β细胞

蛋白名称(可保密):******

蛋白分子量:90-130 KDa

WB用膜类型、孔径:PVDF膜

转膜方式(恒压、恒流):250 mA 恒流

转膜时间:150 min

转膜设备:湿转

蛋白来源:原核表达

蛋白名称(可保密):保密

蛋白分子量:38 KD

WB用膜类型、孔径:0。45 NC

转膜方式(恒压、恒流):湿转 恒压:100 V

转膜时间:120 min

蛋白来源:心脏

蛋白名称(可保密):

蛋白分子量:220 kDa,130 kDa,70 kDa,41kDa

WB用膜类型、孔径:PVDF

转膜方式(恒压、恒流):恒压

转膜时间:70 v120 min,180 min,5-6 h

转膜设备:伯乐湿转

建议改进方向(可选):40 kDa一下,70 v ,60-90 min足够,40-70 kDa 90-120 min即可。

70-120 kDa ,70 v,120-180 min足够,120-180 kDa ,180-240 min,180 kDa以上建议6 h。

蛋白来源:卵巢癌细胞膜蛋白

蛋白名称(可保密):

蛋白分子量:53 KD

WB用膜类型、孔径:PVDF膜 0.45 um

转膜方式(恒压、恒流):恒压

转膜时间:80 V 100 min

转膜设备:湿转 Bio-Rad

蛋白来源:人宫颈癌HELA细胞总蛋白

蛋白名称(可保密):β-actin

蛋白分子量:42

WB用膜类型、孔径:PVDF膜 0.45 um

转膜方式(恒压、恒流):恒压

转膜时间:50 4 h

转膜设备:湿转 Bio-Rad

 

蛋白来源:脑组织

蛋白名称(可保密):

蛋白分子量:16 KD、27 KD、32 KD、42 KD

WB用膜类型、孔径:PVDF 0.22 um

转膜方式(恒压、恒流):半干转 恒流 1 mA/cm2或2 mA/cm2

转膜时间:不定

转膜设备:北京六一仪器

建议:我共做了六个蛋白,所以总在想节约时间的方式。

在预试时我会观察电压数与转膜效率的关系,所以我不会按时间来定何时转完,而是按电压来定。通过染胶来确定电压数与转移蛋白分子量上限的关系。这样有的5分钟就转完了,不用多浪费时间。并且六一的半干转膜仪随着使用次数的增多,效率也会下降,所以时间和转膜效率(尤其是使用后期)的关系并不稳定,单纯依靠时间有时会有问题。

蛋白来源:CHO cell

蛋白名称(可保密):酶原

蛋白分子量:40 KD

WB用膜类型、孔径:0.22的PVDF膜(Biorad)

转膜方式(恒压):100 V,湿转,转膜时间:60 min。

设备:Tanon(上海天能)

建议:

1。 转膜液现用现配,用完倒掉。

2。 转膜时间,电压可以适当调整。分子量大或者小一些的蛋白,采用此条件一样转膜效率很高。

蛋白来源:Hepg2

蛋白名称(可保密):EGFR

蛋白分子量:170kd

WB用膜类型、孔径:pvdf 0。45

转膜方式(恒压、恒流):24V

转膜时间:2个半小时

转膜设备:伯乐半干转

 

蛋白来源:肝癌细胞

蛋白名称:HIF-1α

蛋白分子量:120 kD

WB用膜类型、孔径:NC膜

转膜方式(恒压):80伏,湿转
转膜时间:150分钟

设备:“Bio-Rad mini”

建议:湿转,转膜液特别重要,否则会导致电压或者电流不稳影响转膜条带。转膜均现配先用,不重复利用。转膜时间一般是150分钟,80伏恒压。经李春红染色,靠近蛋白胶的一侧膜上蛋白染色深,膜另外一面染色浅,说明蛋白未转过。该湿转条件自己做过的蛋白分子量范围:170-36 kD。

蛋白来源:心肌细胞总和膜

蛋白名称(可保密):

蛋白分子量:128 KD,100,60,55,43 KD

WB用膜类型、孔径:NC膜 0.2 um

转膜方式(恒压、恒流):恒压

转膜时间:70 V 200 min

转膜设备:湿转 Bio-Rad

建议:转膜液hao现配现现用,或配成母液,hao不重复使用,70 V电压下,电流约154 mA。甲醇可以加到150 ml。对大分子量如200 KD转膜时间延长6-8 h。

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