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抗血清中去除交叉反应性抗体实验
点击次数:170 发布时间:2019-03-05
试剂、试剂盒

封闭缓冲液封闭液细胞悬浮缓冲液抗体LB 培养基

仪器、耗材

Sorval GSA 转子或相当转子适用于处理细菌的超声波破碎仪大肠杆菌 Y1090 hsdR

实验步骤

材料

缓冲液和溶液

贮存缓冲液和试剂的组分请见时录 12。
将贮存液稀释到适当的浓度。

封闭缓冲液

10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
150 mmol/L NaCl
0.05%(V/V)Tween-20

封闭液(1%m/V 明胶,3%m/V 牛血清白蛋白,或 5%m/V 脱脂奶粉)
这些封闭试剂的优点,不同实验室备执一词。我们建议使用者进行预试验确定哪种封闭液与所选择的第一抗体和第二抗体匹配最you。封闭液可以贮存于 4°C,重复使用数次。加人终浓度为 0.05%(m/V)的die氮化钠用以抑制微生物的生长。

细胞悬浮缓冲液

50 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
10 mmol/L EDTA(pH8.0)
过滤除菌,以 50 ml 等分后贮存于 4°C。

抗体

制备用于文库筛选的抗体

培养基

LB 培养基

离心机和转子

Sorval GSA 转子或相当转子

专用设备

适用于处理细菌的超声波破碎仪

载体和菌株

大肠杆菌 Y1090 hsdR
该菌株可以从 Stratagene,Life Technologies 或 ATCC(www,atcc.org) 获得。

方法

1. 在 LB 培养基中培养 100 ml 大肠杆菌 Y1090 hsdR 株达到饱和。

2. 于 4°C 以 5000 g 离心10min 收获细菌。

3. 细菌重悬于 3 ml 细菌悬浮缓冲液中。反复冻融数次,再于 0°C 用最大功率超声波处理 6 次,每次 20s。

4. 提取液于 4°C 以 12000g 离心 10 min, 将上清液转移到另一试管内,所得裂解液贮存于-20°C。

5. 使用裂解液前先用封闭液以 1:10 稀释用于筛选的抗体制剂。

6. 每毫升抗血清中加入 0.5 ml 大肠杆菌裂解液。置室温缓慢摇动温育 4 h。处理后的抗体加入 0.05% die氮化钠,保存于 4°C 以备免疫筛选时使用。

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