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Western Blot中如何选择内参抗体?
点击次数:104 发布时间:2019-04-09

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Western Blot

Western Blot 即免疫印迹试验,可以利用 Western Blot 来比较在不同条件下,不同细胞组织中目的蛋白表达量的差异,属于定性,半定量试验。既然有差异性比较,参照物必不可少。Western Blot 试验中的标准(表达量)参照物即内参,有了参照物才能准确地比较目的蛋白表达量的差异。内参一般选用管家基因表达的蛋白,它们在各个组织细胞中表达相对恒定,不会因为外部条件变化而引起表达量的变化。而且内参可以监测整个试验体系是否正常,比如蛋白提取过程,转膜体系,显色体系等。

beta Actin、beta Tubulin、GAPDH、Lamin B1、PCNA 等已作为成熟的内参运用到试验中,下面就大致介绍下如何选择内参:

样本来源

● 如果是哺乳动物的组织或细胞,主要以 beta Actin、beta Tubulin、GAPDH、Lamin B1、PCNA 为代表;

● 如果是植物样本,主要以 actin、Rubisco 为代表。

目的蛋白定位

● 全细胞蛋白和细胞质:beta Actin、beta Tubulin、GAPDH 等;

● 细胞核蛋白: PCNA 等;

● 核膜蛋白:Lamin B1 等;

● 胞膜蛋白:Na(+)/K(+) ATPase 等。

目的蛋白分子量

beta Actin、beta Tubulin、GAPDH 的分子量分别是 42kd,50kd,37kd,目的蛋白分子量最hao能与内参蛋白分子量相差 5kd 以上,才能分开目的蛋白和内参,写文章做图也更美观;

三大内参

beta Actin,肌动蛋白,细胞骨架蛋白。它们在各组织和细胞中的表达相对恒定,在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。beta Actin 作为内参是得到公认的,针对大多数组织和细胞来说的,它广泛分布于细胞质内,表达量非常丰富。但是在一些少量特殊的情况下比如脂肪组织和细胞内,beta Actin 的表达量就很少。

GAPDH,甘油醛-3-磷酸脱氢酶,该酶是糖酵解反应中的一个酶,几乎在所有组织细胞中都高水平表达,在同种细胞或组织中的表达量一般是恒定的,且很少受外部诱导物的影响。但比如缺氧和糖尿病等疾病存在下,会增加 GAPDH 在特定细胞和组织中的表达。

beta Tubulin,微管蛋白,细胞骨架蛋白。作为内参抗体,beta Tubulin 表达通常不会发生改变,因此被广泛用于 Western Blot 内参,也常被用于免疫染色观察细胞的微管结构。

下面是多年项目经理在开发抗体时的一点心得,希望对大家有帮助。

1. 不同的内参在选择上也要根据具体的样本情况选择,没有一种内参能适用所有的组织和细胞样本。比如,血红细胞(因为其细胞结构的特殊性和需要携带氧气的功能性)样本就不适合以上 3 种常用内参。如果使用会导致结果很差或者没有结果。可以选用血红细胞的结构性蛋白作为内参代替。

2。 在做多组织多细胞样本对比表达量时,最hao选用 GAPDH 作为内参,因为 GAPDH 是代谢类蛋白,在活组织中表达比较恒定。而 beta Actin 和 beta Tubulin 是结构蛋白,不同组织的细胞结构会有差异性,如脑组织的 tubulin 的表达会高一些(因为神经细胞的轴突和树突都由 tubulin 维持结构),而 actin 的表达量可能会低一些。再比如,骨骼肌、心肌和平滑肌的特殊功能反而导致了 tubulin 的表达改变和特化。心肌的 beta Actin 的表达量可能变少,而 alpha Actin 表达量高。因为这些组织的差异,现在慢慢采用总 Actin 和总 tubulin 作为内参,可以尽量减少一些组织表达量差异。

3。 做各种分泌液样本的时候,如血浆,乳汁,组织液等,以上的 3 种内参也不是很合适。由于没有完整的细胞结构,所以只能选择一些分泌蛋白作为内参,或者采用其他方式作为内参。

4。 做诱导后样本或检测磷酸化等修饰性抗体时,选择结构蛋白作为内参,如 beta Actin 和 beta Tubulin。因为 GAPDH 是代谢类蛋白,表达量有可能会受到诱导处理的影响。同时,做修饰性抗体的 Western Blot 实验,最hao也带上同抗原的总抗作为阳性对照。

5. 做 Western Blot 实验时,内参的条带强度也要适当控制。不要让内参条带发生过度曝光的情况,尤其是用 X 胶片曝光的。如果内参条带过度曝光,条带会显得很宽,妨碍对条带正确强度的判读,进而影响对其他实验结果的判断。最hao的内参结果是: 窄窄的,黑色实心条带。

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