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家兔椎间盘细胞培养实验
点击次数:40 发布时间:2019-10-29
实验方法原理首先建立家兔椎间盘细胞的体外培养系统,其中,第yi组给予纯氧,另外3组给予不同浓度的臭氧:30 ug/ml,60 ug/ml和80 ug/ml,然后于15 min及30 min后,采用台盼蓝细胞排斥试验计算椎间盘细胞的活细胞率。
实验材料

家兔

试剂、试剂盒

培养液DMEMHanks’缓冲液胎牛血清胰岛素转铁蛋白ya硒酸盐青霉素链霉素

仪器、耗材

培养皿培养瓶烧瓶试管眼科剪、眼科镊CO2 培养箱pH 计恒温水浴

实验步骤

一、实验步骤
 

1.  组织块贴块法

 

(1)取材:空气栓塞法处死家兔后,在无菌状态下获取家兔椎间盘组织。置于准备好的DMEM 培养基(含双抗)。迅速带回到无菌超净台上。


(2)剪切:在超净台上,进一步将周围组织分离,用Hanks'液冲洗数遍,直到冲洗液透明为止。眼 科剪刀将组织修剪为1~2 cm大小的小组织块,Hanks'冲洗干净。加入少量含血清的培养液。(组织块不宜过小,否则不容易爬出足够数量的细胞)。

 

(3)接种:用吸管吸取小组织块入培养瓶底部,摆放均匀,一个25 cm的培养瓶可放置10-15 个小组织块,翻转培养瓶,加入少量培养液。4~6 小时后,待组织块充分贴壁后,再翻转回来(动作一定要轻巧, 以免刚刚贴壁的组织块脱离瓶底)。

 

(4)于5% CO孵箱中培养,每隔 3 天换液。待细胞 95%融合时,0.25%胰蛋白酶传代分瓶。

 

2.  酶消化法

 

(1)前面步骤同组织块贴块法 1、2。

(2)组织块再进一步剪切,此时培养液中zui好不加血清。

(3)完毕后,加入消化液,移入到10  ml 离心管,培养箱内消化。

(4)每隔20 分钟,用吸管吹打一次,观察液体有否变浑浊,并取少量液体,在相差倒置显微镜下观察。

(5)0.4%台盼兰染色计算活细胞数目。

(6)接种密度在10数量级。置于5%CO孵箱中培养,每隔 3 天换液。

(7)待细胞 95%融合时,0.25%胰蛋白酶传代分瓶。

二、结果

IVD 细胞为类软骨细胞,描述:单层细胞形状不规则,可呈三角形、多角形,梭形及不规则形。不同于成纤维细胞。如下图:

图1:组织块贴块法
 

图2:传代细胞形态
 

图3:细胞传代前状态95%融合

收起 
注意事项

 椎间盘位于相邻两个椎体之间,取材过程较为繁琐, 要求动作迅速,争取在家兔死后半小时内完成,否则,该组织对缺氧耐受性差导致培养失败。

 

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